萤火虫的发光，简单来说，是荧光素（luciferin）在催化下发生的一连串复杂生化反应；而光即是这个过程中所释放的能量。由于不同种类的萤火虫，发光的型式不同，因此在种类之间自然形成隔离。萤火虫中绝大多数的种类是雄虫有发光器，而雌虫无发光器或发光器较不发达。虽然我们印象中的萤火虫大多是雄虫有两节发光器、雌虫一节发光器，但这种情况仅出现于熠萤亚科中的熠萤属（Luciola）及脉翅萤属（Curtos）。因为像台湾窗萤（Pyrocoelia analis），雌雄都有两节发光器，两者最大的区别在于雌虫为短翅型，而雄虫则为长翅型。 萤火虫的发光器是由发光细胞、反射层细胞、神经与表皮等所组成。如果将发光器的构造比喻成的车灯，发光细胞就有如车灯的灯泡，而反射层细胞就有如车灯的灯罩，会将发光细胞所发出的光集中反射出去。所以虽然只是小小的光芒，在黑暗中却让人觉得相当明亮。 而萤火虫的发光器会发光，起始于传至发光细胞的神经冲动，使得原本处于抑制状态的荧光素被解除抑制。而萤火虫的发光细胞内有一种含磷的化学物质，称为荧光素，在荧光素的催化下氧化，伴随产生的能量便以光的形式释出。由于反应所产生的大部分能量都用来发光，只有2~10%的能量转为热能，所以当萤火虫停在我们的手上时，我们不会被萤火虫的光给烫到，所以有些人称萤火虫发出来的光为“冷光”。 至于萤火虫发光的目的，早期学者提出的假设有求偶、沟通、照明、警示、展示及调节族群等功能；但是除了求偶、沟通之外，其它功能只是科学家观察的结果，或只是臆测。直到近几年，才有学者验证了警示说：1999年，学者奈特等人发现，误食萤火虫成虫的蜥蜴会死亡，证实成虫的发光除了找寻配偶之外，还有警告其它生物的作用；学者安德伍德等人在1997年以老鼠做的试验，证实幼虫的发光对于老鼠具警示作用。 萤火虫于夜晚的发光行为，以黑翅萤（Luciola cerata）为例，就目前的研究发现，多是在日落后，雄虫开始在栖地上边飞边亮；在雄虫开始活动不久后，雌虫便开始出现于栖地周围的高处（雌虫也会发光，但只有发光器一节，雄虫则有两节发光器），从晚上7点一直到11点半左右，在其栖地可以见到成百成千的萤火虫发光，但差不多在晚上11点半过后，成虫便逐渐停止发光。而且雄虫发光的频率也有变化，并非整晚的发光频率都一样。